病毒滴度是衡量病毒感染性強(qiáng)弱的核心指標(biāo)，直接影響病毒學(xué)基礎(chǔ)研究及疫苗研發(fā)的準(zhǔn)確性與可靠性。病毒滴度測定的關(guān)鍵前提是獲得高質(zhì)量、高純度的病毒核酸，其提取效率與純度直接決定后續(xù)qPCR、數(shù)字PCR等檢測方法的靈敏度與重復(fù)性。

傳統(tǒng)病毒核酸提取依賴手動操作，存在操作步驟繁瑣、耗時較長（單次提取需40~60min）、人為誤差大、易交叉污染等問題，尤其在疫苗研發(fā)的批量樣本（如發(fā)酵液、純化中間品）檢測中，難以滿足高效、標(biāo)準(zhǔn)化的需求。博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的核酸提取儀基于磁珠法原理，整合樣本裂解、核酸結(jié)合、洗滌、洗脫全流程自動化操作，具有提取效率高（單次可處理96份樣本，耗時<25min）、操作標(biāo)準(zhǔn)化、污染風(fēng)險低等優(yōu)勢，但該儀器在病毒滴度測定場景中的應(yīng)用效果尚未系統(tǒng)驗證。

一、材料與方法

（一）實驗材料

1、儀器：博清生物核酸提取儀；實時熒光定量PCR儀；高速離心機(jī)。

2、病毒樣本：SARS-CoV-2病毒株；甲型流感病毒H1N1株；重組腺病毒Ad5-EGFP株，均經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，病毒液濃度梯度為101~10?TCID50/mL。

3、試劑：磁珠法病毒核酸提取試劑盒；酚-氯仿-異戊醇混合液；SuperScript III One-Step qRT-PCR Kit；SARS-CoV-2 ORF1ab基因引物探針、H1N1 HA基因引物探針、Ad5 E1A 基因引物探針。

4、標(biāo)準(zhǔn)品：SARS-CoV-2 RNA標(biāo)準(zhǔn)品。

（二）實驗方法

1、病毒樣本預(yù)處理

取各病毒液（101~10? TCID50/mL），每濃度梯度設(shè)3個重復(fù)，4℃下8000×g離心10min，去除細(xì)胞碎片，取上清液作為核酸提取樣本，體積均為 200μL。

2、核酸提取

試驗組（博清生物核酸提取儀）：按照儀器操作說明書，將200μL病毒上清液與20μL蛋白酶K、200μL裂解液混合，加入儀器樣本孔，選擇“病毒核酸提取程序”（裂解溫度56℃，時間10min；洗脫體積50μL），自動完成提取，收集洗脫液即為病毒核酸。

對照組（傳統(tǒng)手動酚-氯仿法）：取200μL病毒上清液，加入200μL酚-氯仿-異戊醇混合液，渦旋振蕩5min，12000×g離心10min，取上層水相；加入等體積異丙醇沉淀核酸，-20℃靜置30min，12000×g離心15min，棄上清；75%乙醇洗滌沉淀2次，晾干后用50μL無酶水溶解，即為病毒核酸。

3、核酸質(zhì)量檢測

采用超微量分光光度計測定核酸濃度（ng/μL）及純度（A260/A280比值，合格范圍1.8~2.0）；每個樣本重復(fù)檢測3次，計算均值與標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。

4、病毒滴度測定（qPCR法）

qPCR反應(yīng)體系：20μL體系，含SuperScript III酶混合液10μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.8μL、探針（5μmol/L）0.4μL、病毒核酸模板2μL、無酶水6μL。

qPCR反應(yīng)條件：逆轉(zhuǎn)錄階段50℃ 30min；預(yù)變性95℃ 2min；擴(kuò)增階段95℃ 15s、60℃ 30s，共40個循環(huán)，收集熒光信號。

滴度計算：以SARS-CoV-2 RNA標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（CT值與拷貝數(shù)對數(shù)的線性回歸方程），根據(jù)樣本CT值計算病毒核酸拷貝數(shù)；結(jié)合病毒培養(yǎng)體系體積與稀釋倍數(shù)，換算為病毒滴度（TCID50/mL），公式參考Reed-Muench法。

5、數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量數(shù)據(jù)以“均值±SD”表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）核酸提取效率與純度對比

試驗組對3種病毒樣本的核酸提取濃度均顯著高于對照組（P<0.01），且A260/A280比值更接近理想范圍（1.8~2.0），無明顯蛋白或有機(jī)溶劑污染。其中，SARS-CoV-2樣本的提取濃度提升最顯著，試驗組均值（302.4ng/μL）較對照組（201.7ng/μL）提高50.0%。

（二）核酸提取重復(fù)性分析

試驗組對同一濃度病毒樣本（10? TCID50/mL）的3次重復(fù)提取中，核酸濃度的CV值均 <4.2%，顯著低于對照組（CV>7.5%）；qPCR檢測的CT值變異系數(shù)同樣表現(xiàn)更優(yōu)，試驗組CV均<3.8%，對照組CV>6.9%，表明博清生物核酸提取儀的操作標(biāo)準(zhǔn)化程度更高，重復(fù)性更穩(wěn)定。

（三）病毒滴度測定結(jié)果對比

兩種方法測定的病毒滴度呈強(qiáng)正相關(guān)（R2=0.986，P<0.001），但試驗組測定結(jié)果更接近標(biāo)準(zhǔn)品參考值。以SARS-CoV-2 10? TCID50/mL標(biāo)準(zhǔn)樣本為例，試驗組測定值為（9.8±0.3）×103 TCID50/mL，誤差僅2.0%；對照組測定值為（8.2±0.5）×103 TCID50/mL，誤差達(dá)18.0%，表明博清生物核酸提取儀可提升病毒滴度測定的準(zhǔn)確性。

三、討論

本研究從核酸提取效率、重復(fù)性及滴度測定準(zhǔn)確性三個核心維度，驗證了博清生物核酸提取儀在病毒學(xué)研究與疫苗研發(fā)中的適用性，其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下三方面：

（一）高效提取與高純度核酸：博清生物核酸提取儀采用磁珠法特異性結(jié)合病毒核酸，配合自動化裂解與洗脫程序，避免了傳統(tǒng)酚-氯仿法中有機(jī)溶劑殘留、蛋白污染等問題，使核酸純度（A260/A280≈1.89）更符合qPCR檢測需求；同時，儀器單次提取耗時<25min，且支持96份樣本批量處理，顯著提升疫苗研發(fā)中批量樣本（如發(fā)酵液、純化中間品）的檢測效率。

（二）穩(wěn)定的重復(fù)性：傳統(tǒng)手動提取依賴操作人員的技術(shù)熟練度，易因加樣誤差、離心時間差異等引入人為干擾；而博清生物儀器通過標(biāo)準(zhǔn)化程序控制溫度、轉(zhuǎn)速、試劑加樣量等關(guān)鍵參數(shù)，使核酸濃度與qPCR CT值的CV均<4.2%，滿足疫苗生產(chǎn)中“批次一致性”的質(zhì)控要求。

（三）準(zhǔn)確的滴度測定結(jié)果：病毒滴度測定的準(zhǔn)確性依賴核酸提取的完整性——博清生物儀器的裂解緩沖液可高效破壞病毒衣殼，釋放RNA/DNA，減少核酸降解；結(jié)合其高提取效率，使qPCR檢測的靶基因拷貝數(shù)更接近實際病毒量，滴度測定誤差<5%，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法（誤差>15%），為疫苗抗原含量標(biāo)定、病毒致病機(jī)制研究提供可靠數(shù)據(jù)。

本研究的局限性在于未涉及復(fù)雜基質(zhì)樣本（如含血清的病毒培養(yǎng)上清）的提取效果，后續(xù)可進(jìn)一步驗證儀器在臨床樣本或疫苗生產(chǎn)復(fù)雜基質(zhì)中的應(yīng)用性能。此外，博清生物核酸提取儀可與qPCR儀聯(lián)動，構(gòu)建“提取-檢測”一體化流程，未來可探索其在病毒快速診斷與疫苗應(yīng)急研發(fā)中的應(yīng)用潛力。

博清生物科技（南京）有限公司研發(fā)的核酸提取儀可高效、穩(wěn)定地完成SARS-CoV-2、甲型流感病毒、重組腺病毒等多種病毒的核酸提取，其提取的核酸濃度高、純度優(yōu)，且重復(fù)性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)手動方法。該儀器可通過提升核酸提取質(zhì)量，保障后續(xù)qPCR檢測的準(zhǔn)確性，進(jìn)而實現(xiàn)病毒滴度的精準(zhǔn)測定，適用于病毒學(xué)基礎(chǔ)研究、疫苗研發(fā)及生產(chǎn)質(zhì)控等場景，具有較高的推廣應(yīng)用價值。